Какво е в основата на ДНК хибридизацията? Въпреки че двуверижната ДНК последователност обикновено е стабилна при физиологични условия, промяната на тези условия в лабораторията (обикновено чрез повишаване на температурата на околната среда) ще доведе до разделяне на молекулите на отделни вериги. Последните са взаимно допълващи се, но могат също да допълват други последователности, присъстващи в тяхната среда. Понижаването на температурата на околната среда позволява на едноверижните молекули да се отгряват или "хибридизират" една с друга. Това е методът на ДНК хибридизация.
Концепцията от гледна точка на молекулярната биология
Учените, участващи както в репликацията на ДНК, така и в транскрипцията на ДНК в РНК, разчитат на нуклеотидни кросоувъри и техники на молекулярна биология. Това включва Southern и Northern блотове, полимеразна верижна реакция (PCR) и повечето подходи за ДНК-РНК хибридизация и секвениране.
Заявление
Хибридизацията е основното свойство на нуклеотидапоследователности и се използва в множество методи на молекулярната биология. Цялостната генетична връзка на два вида може да се определи чрез хибридизиране на сегменти от тяхната ДНК (ДНК-ДНК хибридизация). Поради сходствата на последователностите между тясно свързани организми, е необходима по-висока температура за стопяване на такива ДНК хибриди в сравнение с по-далечни организми. Различни методи използват хибридизация за определяне на произхода на ДНК проба, включително полимеразна верижна реакция (PCR). При друг метод, къси ДНК последователности се хибридизират с клетъчна иРНК за идентифициране на експресирани гени. Фармацевтичните компании проучват използването на антисенс РНК за свързване с нежелана иРНК, предотвратявайки транслирането на иРНК на рибозомата в протеин.
ДНК-ДНК хибридизация обикновено се отнася до техника на молекулярна биология, която измерва степента на генетично сходство между групи от ДНК последователности. Обикновено се използва за определяне на генетичното разстояние между два организма. Той е широко използван във филогенезата и таксономията.
Методология
ДНК от един организъм е маркирана, след което се смесва с немаркирана ДНК, която може да бъде сравнена с него. Сместа се инкубира, за да се позволи на нишките на ДНК да се дисоциират и след това се охлажда, за да се образува регенерирана хибридна двойноверижна ДНК. Хибридизираните последователности с висока степен на сходство ще се свържат по-здраво и ще изискват повече енергия за разделянето им: т.е. те се разделят при нагряване при по-високатемпература от различни последователности, процес, известен като "топене на ДНК".
Стопяване на ДНК
Оценявайки профила на топене на хибридизираната ДНК, двойно-верижната ДНК се свързва с така наречената "колона" и получената смес се нагрява. На всяка стъпка колоната се промива и ДНК последователностите, които се стопяват, стават едноверижни и се отмиват от колоната. Температурите, при които белязаната ДНК излиза от колоната, отразява степента на сходство между последователностите (и моделът на самосгъване служи като контрола). Тези резултати се комбинират, за да се определи степента на генетично сходство между организмите. Според съвременната микробиология ДНК хибридизацията е невъзможна без разбирането на тези неща.
Когато множество видове рибонуклеинова киселина (или дезоксирибонуклеинова) киселина се сравняват по този начин, стойностите на сходството позволяват видът да бъде поставен във филогенетичното дърво. Следователно това е един от възможните подходи за провеждане на молекулярна систематика. Чарлз Сибли и Джон Алкуист, пионерите на тази техника, използваха ДНК-ДНК хибридизация за изследване на филогенетичните взаимоотношения на птиците (таксономия на Сибли-Алкуист) и приматите.
Важност за биологията
ДНК-ДНК хибридизацията е златният стандарт за разграничаване на бактериални видове, със стойност на сходство над 70%, което показва, че сравняваните щамове принадлежат към различни видове. През 2014 г. беше предложен праг от 79% сходство за отделяне на бактериален подвид.
Критиците твърдят, че техниката е неточна за сравняване на тясно свързани видове, тъй като всеки опит за измерване на разликите между ортологичните последователности между организмите е затрупан от хибридизацията на паралогични аналози в генома на организма. ДНК секвенирането и изчислителните сравнения на последователности в момента са често използвания метод за определяне на генетично разстояние, въпреки че този подход все още се използва в микробиологията, за да помогне за идентифицирането на бактерии.
Настоящият начин е да се проведе ДНК-ДНК хибридизация в силикон, използвайки напълно или частично секвенирани геноми. GGDC, разработен от DSMZ, е най-точният известен инструмент за изчисляване на стойности, подобни на DDH. Наред с други алгоритмични подобрения, той решава проблема с паралогичните последователности, като внимателно ги филтрира от съвпадения между две геномни последователности.
ФИШ метод
Флуоресцентната хибридизация на място (FISH) е лабораторна техника, използвана за откриване и секвениране на ДНК, често върху специфична хромозома.
През 1969 г. Джоузеф Гал и Мери Лу Парду публикуваха документ, демонстриращ, че радиоактивни копия на рибозомна ДНК последователност могат да се използват за откриване на комплементарни ДНК последователности в ядрото на жабешко яйце. След тези първоначални наблюдения, много усъвършенствания са увеличили гъвкавостта ичувствителността на процедурата до такава степен, че in situ хибридизацията ("на място", латински) сега се счита за важен инструмент в цитогенетиката. (Терминът in situ вече се използва и за обозначаване на началния етап на растеж на карцинома, когато в патологичния процес участва само епителна тъкан.)
Флуоресцентна хибридизационна последователност
РНК сондите могат да бъдат проектирани за всеки ген или всяка последователност в ген за визуализиране на lncRNA и miRNA mRNA в тъкани и клетки. FISH се използва чрез изследване на цикъла на клетъчно възпроизвеждане, по-специално на ядрена интерфаза за всякакви хромозомни аномалии. FISH ви позволява да анализирате голяма серия от архивни случаи, много по-лесно е да идентифицирате идентифицираната хромозома чрез създаване на сонда с изкуствена хромозомна база, която ще привлече подобни хромозоми.
Хибридизационни сигнали за всяка сонда, когато се открие ядрена аномалия: всяка сонда за откриване на mRNA и lncRNA се състои от 20 двойки олигонуклеотиди, всяка двойка покрива пространство от 40-50 bp. стр. Пробите използват собствена химия за откриване на иРНК.
Хибридизация с ДНК сонди
Сондите често се правят от ДНК фрагменти, които са изолирани, пречистени и амплифицирани за използване в дизайна на човешкия геном. Размерът на човешкия геном е толкова голям в сравнение с дължината, която може да бъде директно секвенирана, че е необходимо да се раздели нафрагменти. В крайна сметка тези фрагменти бяха подредени чрез разграждане на копие на всеки фрагмент в още по-малки единици, използвайки специфични за последователността ендонуклеази за измерване на размера на всеки малък фрагмент с помощта на хроматография с изключване на размера, като се използва тази информация, за да се определи къде големите фрагменти се припокриват един с друг..
За да се запазят елементите с техните индивидуални ДНК последователности, фрагментите бяха добавени към система от постоянно повтарящи се бактериални популации. Клоналните популации от бактерии, като всяка популация поддържа една изкуствена хромозома, се съхраняват в различни лаборатории по света. Изкуствените хромозоми (BACs) могат да се отглеждат, екстрахират и маркират във всяка лаборатория, съдържаща библиотека. Геномните библиотеки често са кръстени на институциите, в които са разработени. Пример за това е библиотеката RPCI-11, кръстена на Института за рак на Розуел в Бъфало (Ню Йорк, САЩ). Тези фрагменти съставляват около 100 хиляди базови двойки и са в основата на повечето сонди FISH.
