Култивиране на бактерии: методи, принципи, стъпки и условия

2024 Автор: Angel Austin | [email protected]. Последно модифициран: 2023-12-17 05:17

Микроорганизмите в заобикалящата ни природа са навсякъде: в почви, водоеми, на повърхности на различни предмети, хората и животните се обитават от тях. Всичко това може да служи като източници на микробно замърсяване на храни, лекарства и производствени линии. Култивирането на бактерии е необходимо за изследване на техните свойства, нужди и характеристики. Това от своя страна е важна стъпка в разработването на различни лекарства, лабораторна диагностика на заболявания, изчисляване на производствените реактори и много други.

Общи понятия

Култивирането на бактерии в микробиологията се отнася до култивирането на микроорганизми, извършено в лабораторията. От своя страна микробите, които са израснали върху избрана хранителна среда, се наричат култура. Културите могат да бъдат смесени, ако са образувани от различни видове микроорганизми, и чисти, ако са представени само от един вид бактерии.

Ако е хранителнаВ средата се поставя само една клетка и в резултат на нейното възпроизвеждане се получава група индивиди, тогава този набор от микроорганизми се нарича клонинг. Когато клонингът се развие до точката, в която стане видима с просто око, тази колекция от бактерии се нарича колония.

Обикновено култивирането на бактерии, изолирани от различни източници, се извършва отделно един от друг. Всяка такава отделно отгледана група микроби се нарича щам. Така че, ако един вид стафилокок е изолиран от три източника (или различни части от един и същ продукт, различни хора), те говорят за три щама от този тип стафилококи.

Растежни фактори на бактерии

Те включват различни аминокиселини, липиди, пуринови бази и други съединения, необходими за развитието на микроорганизми. Някои микроби могат самостоятелно да произвеждат необходимите им вещества, докато други трябва да ги получават в завършен вид. Според нуждите на микроорганизмите в определени растежни фактори се извършва идентификация и диференциация на бактериите. Също така, този параметър е важен за правилното приготвяне на хранителна среда за лабораторна и биотехнологична работа:

Аминокиселини. Бактериите може да изискват една конкретна аминокиселина или група киселини. И така, клостридиите се нуждаят от левцин и тирозин, стрептококите се нуждаят от левцин и аргинин. Микроорганизмите, които изискват аминокиселини отвън, за да растат, се наричат ауксотрофи.
Пуринови и пиримидинови бази, както и техните производни (аденин, гуанин и други). Те са важен фактор за растежа на много хораВидове Streptococcus.
Витамини. Те са част от коензимите, необходими на бактериите. И така, никотинова киселина, както и нейният амид, които са част от NAD и NADP, са необходими на дифтериите и коринебактериите от шигела. Тиаминът, като неразделна част от пирофосфата, се изисква от Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Пантотеновата киселина, която е част от коензима CoA, се изисква от тетанус бацили и някои видове стрептококи. Цитохромите и следователно фолиевата киселина, хемите и биотинът, които ги образуват, са необходими за Mycobacterium tuberculosis и Haemophilus influenzae.

Изисквания за околната среда

Условия за културална среда за култивиране на бактерии:

Хранене. Те трябва да съдържат вещества, освен това в лесно смилаема форма, необходими на микроорганизмите да се хранят и попълват енергия. Те включват органогени и минерали. Някои микроорганизми изискват допълнително витамини и аминокиселини, които не могат да синтезират.
Оптимално ниво на pH. Той засяга пропускливостта на клетъчната мембрана и съответно способността да абсорбира хранителните вещества от бактерията. Най-често стойността на pH трябва да бъде на ниво 7, 2–7, 4. Много микроорганизми в хода на живота си произвеждат продукти с киселинни или алкални реакции и за да не се променя pH на хранителната среда, трябва да бъде буфериран.
Изотоник. Осмотичното налягане в хранителната среда за култивиране на бактерии трябва да има същите стойности катовътре в микробните клетки. Обикновено съответства на 0,5% разтвор на NaCl.
Стерилност. Това се дължи на факта, че появата на чужди бактерии ще изкриви резултатите от изследването на анализирания щам.
Ниво на влажност. Този индикатор, заедно с консистенцията на средата, трябва да има оптимални характеристики за определен тип бактерии.
редокс потенциал (RH2). Той показва съотношението на веществата, които даряват и приемат електрони, както и нивото на насищане с кислород на хранителната среда. За аеробите и анаеробите условията за култивиране на бактериите се различават малко по този показател. Анаеробните микроорганизми се възпроизвеждат най-добре при стойности на RH2 под 5, а аеробните микроорганизми най-малко 10.
Еднородност. Важно е хранителната среда да съдържа постоянни количества от отделните си съставки. Освен това се предпочитат ясни решения, които улесняват наблюдението на растежа на културите или забелязват замърсяване.

Видове културни медии

Изборът на конкретна среда за отглеждане на микроорганизми се влияе от много фактори, сред които са характеристиките на тяхното хранене и целта на изследването. Основните характеристики, залегнали в основата на класификацията на хранителните среди, са:

1. Компоненти. Според първоначалните вещества, използвани за създаване на субстрата, те разграничават:

натурални, които са приготвени от продукти от животински или растителен произход (например месо, мляко, плодове) и са подходящи за отглеждане на смесеникултури;
полусинтетичен, при който скъпите натурални хранителни продукти се заменят с нехранителни продукти (например костно брашно, кръвни съсиреци) и които са оптимални за култивиране на определени видове бактерии или изолиране на техните метаболитни продукти от среда;
синтетични, които се приготвят от точни количества химични съединения, имат известен постоянен състав и са лесно възпроизводими.

2. Консистенция (плътност). Разграничаване на среди:

течност;
плътно;
полутечен.

Последните две се приготвят от специални разтвори или течни вещества с добавка на агар-агар или желатин за създаване на необходимата плътност. В допълнение, плътна среда за растеж на бактерии е съсиреният кръвен серум, картофи, силикагелна среда, карагенан.

3. Съединение. На тази основа среди са:

просто, чийто списък е кратък, е месен пептонен бульон (MBB), бульон и агар Хотингер, месен пептонен агар (MPA), хранителен желатин и пептонна вода.
комплекс, приготвен от прости с добавка на кръв, суроватка, въглехидрати и други вещества.

4. Назначаване. Различават се следните хранителни среди:

main се използват за отглеждане на много патогенни микроби (обикновено прост състав);
специалните се използват за изолиране и култивиране на бактерии, които не растат върху прости субстрати;
селективни (те също са селективни) са подходящи за изолиране на специфичен тип бактерии и инхибират растежа на свързани микроби (селективностсъздаден чрез добавяне на определени вещества към средата, като антибиотици или соли, или чрез регулиране на pH);
диференциалната диагностика позволява да се разграничат един вид бактерии от друг чрез оценка на ензимната активност, например на средата;
за първоначално инокулиране с последващо транспортиране на проби са необходими консерванти, тъй като те предотвратяват смъртта на микроорганизми, както и инхибират растежа на други бактерии.

Подготовка на медиите

Най-важната стъпка в култивирането на анаеробни бактерии е приготвянето на подходяща хранителна среда. След като бъдат избрани оптималните параметри, преминете към следните етапи:

претегляне, като изберете извадка от компоненти на аналитична везна;
разтварянето се извършва в дестилирана вода, загрята до 70°C, като фосфатите, микро- и макросолите се разтварят отделно;
варене на водна баня за две минути;
определяне на pH чрез индикаторна хартия или потенциометър;
филтриране през мокра кърпа или хартиени филтри за течна, както и разтопена плътна среда и през филтър от памучна марля за агарова среда;
бутилиране се извършва на 3/4 капацитет;
средно зависима стерилизация;
контролът за стерилност се извършва чрез престояване за два дни в термостат, последвано от преглед;
химичен контрол за установяване на pH и съдържанието на необходимотоартикули;
биологичен контрол чрез пробна инокулация.

Стерилизация на стъклени съдове и медии

Един от основните принципи на бактериалното култивиране е стерилността. Растежът и развитието на чужди микроорганизми могат да повлияят на характеристиките на хранителната среда чрез промяна на нейния химичен състав и pH. Стерилизацията е основното условие за отглеждане на чисти култури. На практика този термин означава методите за унищожаване на абсолютно всички форми на живот на повърхността и в обема на стерилизираните предмети. Съдовете, използваните инструменти, медиите и други предмети, използвани по време на изследването, се стерилизират.

Някои видове стерилизация:

Запалване. Стерилизацията на бримки и игли за засяване, стъклени предмети, някои инструменти може да се извърши с помощта на горелка или спиртна лампа.
Варене. Подходящ за работа със спринцовки, игли, храна, но не убива бактериални спори.
Стерилизация със суха топлина. Извършва се в специален сушилен шкаф и е подходящ за обработка на колби, епруветки и други лабораторни стъклени съдове.
Стерилизация с пара. Извършен в автоклав, този метод е много ефективен. Но не е подходящ за хранителни среди, съдържащи протеини или други съединения, които се разпадат при високи температури. По-щадящо може да се нарече тиндализация. Извършва се в котела Koch и съчетава покълването на спорите с тяхното унищожаване.
Пастьоризация. Използва се за среди, които променят свойствата си при варене (например мляко, вино, бира), способни нада ги освободят от микроорганизми, които не носят спори. Температурата на обработка е само 50-60 ° C за петнадесет до тридесет минути. В някои случаи се използва студена стерилизация, извършвана с помощта на филтри или UV лъчи.

Условия за отглеждане на бактерии

Растежът и развитието на бактериите са възможни само при определени фактори и стойностите на всеки от тях:

1. температура. Има три групи бактерии, които се различават по температурни предпочитания:

термофилите или топлолюбиви микроби растат при 45-90°C, което означава, че не се размножават в човешки и животински организми;
психрофилите или студолюбивите микроорганизми предпочитат температури в диапазона от 5-15°C и се отглеждат в хладилни складове;
мезофили, развиват се при температура 25-37°C, те включват по-голямата част от бактерии.

2. Светлина. Това е особеност на култивирането на фототрофни бактерии, тъй като те извършват фотосинтетичния процес. Но за повечето микроби осветлението не е задължително условие. И дори обратното, слънчевата ултравиолетова може да потисне тяхното развитие.

3. Вода. Всички микроорганизми се нуждаят от вода в достъпна (течна) форма. Ето защо замразената храна има малък или никакъв растеж на бактерии.

4. Киселинност на околната среда. Този принцип на култивиране на бактерии вече беше обсъден подробно по-горе.

5. Аерация. Кислородът, като химичен елемент, е неразделна част от водата и значителен брой съединения, използвани закултивиране на микроорганизми. Газообразният кислород може също да се съдържа във вода и други течности в разтворена форма. Значителна част от бактериите се нуждаят от постоянно снабдяване с кислородни молекули. Но за редица микроорганизми това е ненужно или, по-лошо, газообразният кислород е токсичен за тях, тъй като те нямат каталаза и пероксидаза, които унищожават токсичните дихателни продукти. Следователно, най-важната стъпка в култивирането на анаеробни бактерии е отстраняването на O₂ молекули от хранителната среда.

6. Култивиране на микроорганизми. Култивирането на аеробни и анаеробни бактерии се извършва в различни слоеве на околната среда и в различни режими.

Култивиране на аеробни микроорганизми

Култивирането на аеробни бактерии изисква молекулен кислород. За получаване на чисти култури от аероби, които могат да се използват успешно в медицината и хранително-вкусовата промишленост, се използват следните методи:

повърхност, растяща върху плътна среда или в течна среда (техният тънък слой), когато кислородът идва директно от въздуха;
дълбоко култивиране в течна среда, когато чрез постоянна аерация се постига увеличаване на количеството кислород, разтворен в тях.

Култивиране на анаеробни микроорганизми

Основният принцип за култивиране на бактерии от този тип е минималният им контакт с атмосферния кислород. Осигуряването на условия за техния растеж е много по-трудно, отколкото за аеробите. Следните методи се използват за изолиране на анаероби от молекулярно O₂:

Физически. Този метод на култивиране на анаеробни бактерии се свежда до култивирането им в специален вакуумен апарат - микроанаеростат. Въздухът в него е заменен от специална газова смес от азот с добавка на 10% водород и 5% въглероден диоксид.
Химически. Те включват: използване на абсорбиращи агенти (напр. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) или редуциращи агенти (като аскорбинова киселина).
Биологична. Свежда се до съвместното култивиране на аероби и анаероби в затворена система. Този метод за култивиране на бактерии включва засяване на едната половина на петриева паничка с някои от аеробните видове бактерии, а другата половина с изследвания анаероб. Неговото развитие ще започне в момента, когато целият кислород се изразходва.

Следните методи за засяване са подходящи за култивиране на анаеробни бактерии:

в повърхностния слой;
в повърхностния слой, напълнен със стерилен парафин;
в гъстотата на гъста хранителна среда;
в дълбоки слоеве вискозна среда.

Получаване на чиста култура

Микробиолозите обикновено работят с проби, обитавани от много различни видове микроби. Въпреки това, за да се определи системното положение на микроорганизмите (семейство, род, вид), както и да се проучат техните характеристики, е необходимо да се изолират и да се отглежда чиста култура. Те са от голямо значение в много хранителни индустрии, например сирене, хляб, квас, вино и др. Култивирането на млечнокисели бактерии дава възможност за получаване наосновен компонент за производството на ферментирали млечни продукти, тесто, какао, силаж и дори пластмаса.

Методът за изолиране на чиста култура в плътна среда се основава на механичното разделяне на клетките на микроорганизма с последващото им изолирано култивиране. Пробата се прехвърля в стерилен обем вода или физиологичен разтвор (обем 10-100 ml) и след това се разклаща в продължение на две минути. За да се извлекат микроорганизми, разположени в дебелината на изследвания материал (например колбаси или сирене), първо се извършва триене на парчетата от пробата със стерилни инструменти с пясък. Материалът, който е претърпял предварителна подготовка, с тегло 1 g или обем 1 ml, се разрежда със стерилна вода 10, 100, 1000 и т.н. пъти. Степента на разреждане се избира така, че да дава концентрация на клетки, съответстваща на възможностите на метода.

Последващото култивиране на микроорганизми е за приготвяне на хранителна среда. Обикновено се избира плътна среда (MPA). Първо се разтопява и охлажда до 45-50 °С и едва след това се излива в няколко петриеви блюда (три до пет парчета), на дъното на които се поставят тампони от изследваното вещество с различна концентрация. След това се извършва смесване на все още незамръзналата хранителна среда и внесения в нея материал. Ето как клетките се фиксират в различни точки от обема на субстрата.

След това блюдата на Петри се поставят в термостат за 2 дни при 22 °C. През това време клетките се размножават до такава степен, че колонията, образувана от всяка една от клетките, става видима с просто око. Всяка от тях е чиста култура от вида на бактериите, от чиито клетки ероза.

След това от петриевите блюда микроорганизмите се субкултивират в отделни епруветки, пълни с хранителна среда. По този начин чистите култури се изолират от смесена проба. Този метод носи името на своя разработчик - R. Koch. Обикновено се нарича още метод на чаша или изчерпваща сеитба. След получаване на чисти култури от различни видове бактерии се определя тяхната форма, спори и семейства.

Всички работи трябва да се извършват в съответствие с принципите на асептика. За да се избегне преждевременното развитие на микроорганизми, изследването трябва да се проведе веднага след вземането на пробата. Водата от чешмата се анализира след източване на първите порции, тъй като те могат да съдържат микроби, натрупани в тръби и кранове. Микрофлората на плодовете, плодовете и зеленчуците се намира главно на повърхността (кора), поради което се извършват измивания от нея. За да направите това, поставете плода в стерилен контейнер и го напълнете с необходимото количество вода. След това се разклащат доста енергично и водата се излива в друг съд. Реколтата от платнени продукти също се получават на тампони, но предварително от тях се изрязват парчета с определен размер.