Молекулярно-биологичните изследователски методи играят голяма роля в съвременната медицина, съдебната медицина и биологията. Благодарение на напредъка в изучаването на ДНК и РНК, човек е в състояние да изучава генома на даден организъм, да определя причинителя на заболяването, да разпознава желаната нуклеинова киселина в смес от киселини и т.н.
Молекулярно-биологични методи за изследване. Какво е?
Назад през 70-те и 80-те години учените за първи път успяват да дешифрират човешкия геном. Това събитие даде тласък на развитието на генното инженерство и молекулярната биология. Изследването на свойствата на ДНК и РНК доведе до факта, че вече е възможно да се използват тези нуклеинови киселини за диагностициране на заболяване, изследване на гени.
Получаване на ДНК и РНК
Молекулярно-биологичните диагностични методи изискват наличието на изходен материал: по-често това са нуклеинови киселини. Има няколко начина за изолиране на тези вещества от клетките на живите организми. Всеки от тях има своите предимства и недостатъци и е необходимвземете предвид при избора на метод за изолиране на чисти нуклеинови киселини.
1. Получаване на ДНК според Мармур. Методът се състои в третиране на смес от вещества с алкохол, в резултат на което се утаява чиста ДНК. Недостатъкът на този метод е използването на агресивни вещества: фенол и хлороформ.
2. Изолиране на ДНК според Boom. Основното вещество, използвано тук, е гуанидин тиоцианат (GuSCN). Той допринася за утаяването на дезоксирибонуклеинова киселина върху специализирани субстрати, от които впоследствие може да бъде събрана с помощта на специален буфер. Въпреки това, GuSCN е инхибитор на PTC и дори малка част от него, която попада в утаената ДНК, може да повлияе на хода на полимеразната верижна реакция, която играе важна роля при работата с нуклеиновите киселини.
3. Утаяване на примеси. Методът се различава от предишните по това, че не се утаяват молекулите на дезоксирибонуклеинова киселина, а примесите. За да направите това, се използват йонообменници. Недостатъкът е, че не всички вещества могат да се утаяват.
4. Масов скрининг. Този метод се използва в случаите, когато не е необходима точна информация за състава на ДНК молекулата, но е необходимо да се получат някои статистически данни. Това се обяснява с факта, че структурата на нуклеиновата киселина може да бъде повредена, когато се третира с детергенти, по-специално алкали.
Класификация на изследователските методи
Всички молекулярно-биологични методи за изследване са разделени на три големи групи:
1. Амплификация (с помощта на много ензими). Туксе отнася до PCR - полимеразна верижна реакция, която играе голяма роля в много от диагностичните методи.
2. Без усилване. Тази група методи е пряко свързана с действието на смеси от нуклеинови киселини. Примери са 3 блота, in situ хибридизация и т.н.
3. Методи, базирани на разпознаване на сигнал от молекула на сонда, която се свързва със специфична ДНК или РНК на сонда. Пример е хибридната система за улавяне (hc2).
Ензими, които могат да се използват в методите за изследване на молекулярната биология
Много молекулярни диагностични методи включват използването на широк спектър от ензими. По-долу са най-често използваните:
1. Рестрикционен ензим - "разрязва" ДНК молекулата на необходимите части.
2. ДНК полимераза - синтезира двуверижна молекула дезоксирибонуклеинова киселина.
3. Обратна транскриптаза (ревертаза) - използва се за синтезиране на ДНК върху РНК шаблон.
4. ДНК лигаза - отговорна за образуването на фосфодиестерни връзки между нуклеотидите.
5. Екзонуклеаза - премахва нуклеотидите от крайните участъци на молекулата на дезоксирибонуклеинова киселина.
PCR е основният метод за амплификация на ДНК
Полимеразна верижна реакция (PCR) се използва активно в съвременната молекулярна биология. Това е метод, при който огромен брой копия могат да бъдат получени от една молекула ДНК (молекулите се амплифицират).
Основни функции на PCR:
- диагностиказаболявания;
- клониране на ДНК сегменти, гени.
Следните елементи са необходими за провеждане на полимеразна верижна реакция: първоначална ДНК молекула, термостабилна ДНК полимераза (Taq или Pfu), дезоксирибонуклеотидни фосфати (източници на азотни основи), праймери (2 праймера на 1 молекула ДНК) и самата буферна система, в която са възможни всички реакции.
PCR се състои от три стъпки: денатурация, отгряване на праймера и удължаване.
1. Денатурация. При температура от 94-95 градуса по Целзий водородните връзки между двете вериги на ДНК се разрушават и в резултат получаваме две едноверижни молекули.
2. Грунд отгряване. При температура от 50-60 градуса по Целзий праймерите се прикрепят към краищата на едноверижни молекули нуклеинова киселина по вида на комплементарност.
3. Удължаване. При температура от 72 градуса се получава синтеза на дъщерни двуверижни молекули дезоксирибонуклеинова киселина.
Секвениране на ДНК
Методите за молекулярно-биологични изследвания често изискват познаване на нуклеотидната последователност в молекулата на дезоксирибонуклеинова киселина. Извършва се секвениране за определяне на генетичния код. Молекулярната диагностика на бъдещето ще се основава на знания, получени от човешкото секвениране.
Разграничават се следните типове последователност:
- Последователност на Максам-Гилбърт;
- Сангер последователност;
- pyrosequencing;
- нанопорпоследователност.
