Абсорбцията и по-нататъшното повторно излъчване на светлина от неорганични и органични среди е резултат от фосфоресценция или флуоресценция. Разликата между явленията е дължината на интервала между поглъщането на светлината и излъчването на потока. При флуоресценция тези процеси протичат почти едновременно, а при фосфоресценция с известно закъснение.
Историческа справка
През 1852 г. британският учен Стоукс за първи път описва флуоресценцията. Той измисли новия термин в резултат на експериментите си с флуорен шпат, който излъчва червена светлина, когато е изложен на ултравиолетова светлина. Стоукс отбеляза интересен феномен. Той откри, че дължината на вълната на флуоресцентната светлина винаги е по-дълга от тази на възбуждащата светлина.
Много експерименти бяха проведени през 19-ти век, за да се потвърди хипотезата. Те показаха, че различни проби флуоресцират, когато са изложени на ултравиолетова светлина. Материалите включват, наред с други, кристали, смоли, минерали, хлорофил,лекарствени суровини, неорганични съединения, витамини, масла. Директното използване на багрила за биологични анализи започва едва през 1930 г.
Описание на флуоресцентна микроскопия
Някои от материалите, използвани в изследванията през първата половина на 20-ти век, са много специфични. Благодарение на показатели, които не могат да бъдат постигнати с контрастни методи, методът на флуоресцентна микроскопия се превърна във важен инструмент както в биомедицинските, така и в биологичните изследвания. Получените резултати бяха от немалко значение за науката за материалите.
Какви са предимствата на флуоресцентната микроскопия? С помощта на нови материали стана възможно да се изолират високоспецифични клетки и субмикроскопични компоненти. Флуоресцентният микроскоп ви позволява да откриете отделни молекули. Разнообразие от багрила ви позволява да идентифицирате няколко елемента едновременно. Въпреки че пространствената разделителна способност на оборудването е ограничена от границата на дифракция, която от своя страна зависи от специфичните свойства на пробата, откриването на молекули под това ниво също е напълно възможно. Различни проби показват автофлуоресценция след облъчване. Това явление се използва широко в петрологията, ботаниката, полупроводниковата индустрия.
Функции
Изследването на животински тъкани или патогенни микроорганизми често се усложнява от твърде слаба или много силна неспецифична автофлуоресценция. Въпреки това, стойността визследванията придобиват въвеждането в материала на компоненти, възбудени при определена дължина на вълната и излъчващи светлинен поток с необходимия интензитет. Флуорохромите действат като багрила, способни да се самоприкрепят към структури (невидими или видими). В същото време те се отличават с висока селективност по отношение на целите и квантовия добив.
Флуоресцентната микроскопия стана широко използвана с появата на естествени и синтетични багрила. Те имаха специфични профили на интензитета на излъчване и възбуждане и бяха насочени към специфични биологични цели.
Идентификация на отделни молекули
Често, при идеални условия, можете да регистрирате сиянието на един елемент. За да направите това, наред с други неща, е необходимо да се осигури достатъчно нисък шум на детектора и оптичен фон. Една флуоресцеинова молекула може да излъчва до 300 000 фотона преди унищожаване поради фотоизбелване. С 20% процент на събираемост и ефективност на процеса, те могат да бъдат регистрирани в размер на около 60 хиляди
Флуоресцентната микроскопия, базирана на лавинни фотодиоди или умножаване на електрони, позволи на изследователите да наблюдават поведението на отделните молекули за секунди, а в някои случаи и минути.
Трудности
Основният проблем е потискането на шума от оптичния фон. Поради факта, че много от материалите, използвани при конструирането на филтри и лещи, проявяват известна автофлуоресценция, усилията на учените в началните етапи бяха насочени към издаването накомпоненти с ниска флуоресценция. Следващите експерименти обаче доведоха до нови заключения. По-специално, флуоресцентна микроскопия, базирана на пълно вътрешно отражение, е установено, че постига нисък фон и висока възбуждаща светлинна мощност.
Механизъм
Принципите на флуоресцентната микроскопия, базирана на пълно вътрешно отражение, са да се използва бързо загниваща или неразпространяваща се вълна. Възниква на интерфейса между среди с различни показатели на пречупване. В този случай светлинният лъч преминава през призма. Има висок коефициент на пречупване.
Призмата е в непосредствена близост до воден разтвор или стъкло с нисък параметър. Ако лъчът светлина е насочен към него под ъгъл, по-голям от критичния, лъчът се отразява напълно от интерфейса. Това явление от своя страна поражда неразпространяваща се вълна. С други думи, генерира се електромагнитно поле, което прониква в среда с по-нисък коефициент на пречупване на разстояние по-малко от 200 нанометра.
При неразпространяваща се вълна, интензитетът на светлината ще бъде достатъчен за възбуждане на флуорофори. Въпреки това, поради изключително малката му дълбочина, обемът му ще бъде много малък. Резултатът е фон на ниско ниво.
Промяна
Флуоресцентната микроскопия, базирана на пълно вътрешно отражение, може да се реализира с епи-осветяване. Това изисква обективи с увеличена числова апертура (поне 1,4, но е желателно тя да достигне 1,45-1,6), както и частично осветено поле на апарата. Последното се постига с малко петно. За по-голяма равномерност се използва тънък пръстен, през който се блокира част от потока. За да се получи критичен ъгъл, след който настъпва пълно отражение, е необходимо високо ниво на пречупване на имерсионната среда в лещите и покривното стъкло на микроскопа.
