Методите за намиране на молекулното тегло на протеин са химически, физико-химични и физични. Най-често срещаните физикохимични методи са гел хроматография (както колонна, така и тънкослойна) и електрофореза в среда от полиакриламиден гел в присъствието на натриев додецил сулфат. Те не изискват сложно оборудване и големи количества тестов материал.
Охарактеризиране на протеини
Протеините са високомолекулни полимери с биологичен произход. Те са изградени от аминокиселини, свързани последователно чрез пептидни връзки. Размерът на протеините зависи от броя на същите тези аминокиселини. Средни стойности на елементния състав на протеините в %:
- carbon - в диапазона от 50, 6-54, 5;
- кислород – в рамките на 21,5-23,5;
- азот - около 15,0-17,6;
- водород - в диапазона от 6, 5-7, 3;
- сяра – в рамките на 0, 3-2, 5;
- минерални вещества - не повече от 0,5.
Протеините се делят на прости, състоящи се само от аминокиселинни остатъци, и сложни, включващи простетични групи. Непротеиновите компоненти могат да бъдат въглехидрати, липиди, нуклеинови киселини, витаминни производни, метални йони, хем и др. Има четири протеинови структури.
Аминокиселинният състав на протеините се установява чрез киселинна хидролиза, комбинирана с последващо разделяне на освободените аминокиселини с помощта на йонообменна хроматография.
Количествените показатели на всяка от аминокиселините се определят по нинхидриновия метод. Разкриването на местоположението на аминокиселините в протеиновата молекула се осъществява чрез последователно разцепване на крайните аминокиселини с помощта на ензими и тяхното идентифициране, което дава възможност да се определи структурата на протеиновата молекула. Идентификацията се основава на техните различни физико-химични свойства. Често за това се използват цветни реакции за определени аминокиселини и хроматография.
Колонна гел хроматография
Този метод се основава на линейната зависимост на логаритъма на молекулното тегло на много глобуларни протеини и обема на елуиране с напълнен гел (с определен размер на порите). По този начин, за да се определи молекулното тегло на протеин, трябва да се намери само обемът на елуирането му от предварително калибрирана колона. Калибрирането се извършва чрез преминаване на протеини с предварително определени маси на молекули през колона и измерване на елуиращите обеми на всяка от тях. Ако сефадекс G-75 се използва като пълнител, тогава изчисляването на молекулното тегло се извършва съгласно уравнението, открито експериментално:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), където M е желаната молекулатегло; Ve – обемът на разтвора с тестваното вещество, напускащо колоната; Vo – свободен обем на колоната.
За анализа ще ви трябва разтвор на син декстран (1%), разтвор на NaCl (0,1 mol/l), Sephadex G-75 (4 g), разтвор на хемоглобин (1%).
Извършване на анализ
Подготвената колона се запълва с гел Sephadex G-75 и се промива с разтвор на NaCl. След като разтворът на NaCl, който се издига над нивото на гела, се отцеди, върху повърхността му внимателно се поставят 0,5 ml разтвор на син декстран. След това течностите, напускащи колоната, се събират в градуиран цилиндър, където се съхраняват до края на експеримента. Разтвор със син цвят, който започва да изтича, се събира по 20 капки в предварително приготвени епруветки. Елуатът от тях, от първия до най-интензивно оцветения, се излива в същия градуиран цилиндър, в който вече са събрани неоцветените фракции. Обемът на епруветките с избледняващия цвят на разтвора не се взема предвид.
Обемът течност, събрана в градуирания цилиндър, е свободният обем на колоната (Vo). След това пълненето на колоната се повтаря, но вместо син декстрин се използва разтвор на хемоглобин. Обемът на елуата в измервателния цилиндър до освобождаване на разтвора с максимално розов цвят е стойността на Ve. Намерените стойности Vo и Ve се заменят в съответното уравнение и се изчислява протеиновата маса. Аминокиселинният състав на протеините се установява по подобни методи.
Тънкослоен гел-хроматография
Принципът на този метод се крие във факта, че по време на придвижването на протеиновия разтвор върху плочата с най-тънкия слой сефадекс, тяхната смес се разпределя неравномерно. От разстоянието, изминато от всеки от протеините от първоначалната начална линия, намерете логаритмите на техните молекулни тегла. За да се определи молекулното тегло на протеин чрез тънкослойна гел хроматография, се изгражда калибровъчна графика, която отразява зависимостта на изминатите от маркерните протеини разстояния от логаритмите на техните молекулни тегла. Вече се използва, дължината на пътя на изследвания протеин и масата на неговата молекула се намират.
За да извършите експеримента, ще ви е необходима сцена с променлив ъгъл на наклон, както и хроматографска камера. От реагентите ще ви трябва Sephadex G-200 или G-150, натриево-фосфатен буфер, pH 7,4 (0,1 mol / l), разтвор на бромофенол синьо (0,1%), CH 3разтворCOOH (5%), CH3COONa разтвор (2%), комплект протеинови маркери, хроматографска хартия.
Извършване на експеримента
Първо е необходимо да се приготви Sephadex гел, за който неговата суха маса от 4 g се суспендира в излишно количество натриево-фосфатен буфер и след това се оставя да набъбне за 3 дни при н.о. Стъклена чиния със страни 20х40 см се измива старателно. Преди да приложите Sephadex върху него, буферът над него се декантира и след това гелът се разбърква добре. Нанася се върху хоризонтално разположена чиния с порцеланова лъжица, след което се разпределя чрез разточване на стъклена пръчка с размери 1х22 см. Разточването се повтаря, докато се разпредели равномерно слой гел без бучки и мехурчета с дебелина 1 мм. Подготвената плака се суши на въздух за 15 минути и след това се поставя в хроматографската камера.
Фосфатен буфер се излива във външните контейнери, гелът се комбинира с буфера с хроматографска хартия. След това камерата се затваря и се поставя на специална стойка. Ъгълът на наклона му е настроен на 7-10°. Оставете камерата за една нощ, за да се насити.
Разтвори на протеини, чието молекулно тегло е известно, както и изследваните проби се прилагат с микропипета, като обемът на всяка порция трябва да бъде 0,02 ml. Плаката се връща в хоризонтално положение и части от протеина се нанасят в определени точки. Разстоянието между тях и от горния ръб трябва да бъде 3 см. След това камерата се затваря и се поставя под ъгъл от 7–10 °. Гел хроматографският анализ се извършва в продължение на 4 часа.
След определеното време камерата се поставя хоризонтално, хроматографската хартия се отстранява. Стъклената плоча се поставя върху стойка в хоризонтално положение и се прави „реплика” върху хроматографска хартия. За да направите това, той се навива в тръба и се нанася върху тънък слой гел, като постепенно се разгъва. В този случай хартията трябва да залепне за нея, но трябва да направите това внимателно, за да я запазите непокътната. Хартията се оставя върху повърхността на плочата за 1 минута, след което се суши при температура 90 °C за 20 минути. и се поставя в специален съд за оцветяване.
Препис на резултатите
За идентифициране на протеиновите зони, "репликата" се поставя в разтвор на бромофенол синьо за 3 минути. По-нататъкбоята трябва да се измие два пъти с разтвор на оцетна киселина и да се фиксира с натриев ацетат. След това хроматографската хартия се измива обилно със студена течаща вода и се изсушава. След това те започват да измерват разстоянието, изминато от всеки протеин от началната точка до центъра на точката.
Според получените данни се изгражда калибровъчна графика чрез начертаване по оста на абсцисата lа/lst (където индекс а се отнася до анализирания, а st - към стандартния протеин), по оста y - lgM. Чрез измерване на разстоянието на протеиновата област на тестовата проба от началото, молекулното тегло и предложената структура на протеиновата молекула се определят с помощта на начертаната графика.
