При изучаване на вещества в органичната химия се използват повече от дузина различни качествени реакции за определяне на съдържанието на определени съединения. Такъв визуален анализ ви позволява незабавно да разберете дали присъстват необходимите вещества и ако не присъстват, можете значително да намалите по-нататъшните експерименти, за да ги идентифицирате. Тези реакции включват нинхидрин, който е основният при визуалното определяне на аминосъединенията.
Какво е това?
Нинхидрин е дикарбонилно съединение, съдържащо един ароматен пръстен с хетероцикъл, прикрепен към него, вторият атом от който има 2 хидроксилни групи (OH-). Това вещество се получава чрез директно окисление на инандион - 1, 3 и следователно, според международната номенклатура, то има следното име: 2, 2 - дихидроксииндион -1, 3 (фиг. 1).
Чистият нинхидрин е жълт или бял кристалцветове, които при нагряване се разтварят добре във вода и други полярни органични разтворители, като ацетон. Това е доста вредно вещество, ако влезе в контакт с кожата в големи количества или лигавиците, причинява дразнене, включително при вдишване. Работата с това съединение трябва да бъде внимателна и само с ръкавици, тъй като когато влезе в контакт с кожата, то реагира с протеините на кожните клетки и я оцветява в лилаво.
Реактивни вещества
Както беше споменато по-горе, реакцията на нинхидрин се използва основно за визуално определяне на съдържанието на аминосъединения:
- α-аминокиселини (включително в протеини);
- аминозахари;
- алкалоиди, съдържащи –NH2 и -NH групи;
- различни амини.
Трябва да се отбележи, че вторичните и третичните амини понякога реагират много слабо, така че са необходими повече изследвания, за да се потвърди тяхното присъствие.
Различни методи на хроматография се използват за количествено определяне, например хартиена хроматография (BC), тънкослойна хроматография (TLC) или с промиване на твърди носители с разтвор на нинхидрин в различни среди.
Тази реакция не е специфична за аминосъединенията, тъй като реагентът може да влезе в нея с всички наведнъж. Въпреки това, от страна на продуктите на реакцията, той има особеност под формата на отделяне на мехурчета въглероден диоксид (CO2), а това е характерно само при взаимодействие с α-амино киселини.
Характеристики на механизма
BВ литературата има различни интерпретации на уравнението на реакцията на нинхидрин. Някои изследователи пропускат образуването на хидриндантин от 2-аминоиндион, който с участието на амоняк и нинхидрин също образува оцветяващо вещество, наречено „лилаво на Руман“(или „синьо на Руман“), докато други, напротив, приемат само неговото участие без наличието на междинни аминопродукти. Има и някои интересни точки в записа на самата реакция, по-специално това се отнася до методите за прикрепване на аминопроизводното на нинхидрина към основната му молекула за образуване на багрило. Посочването на мястото на „ходещия водород“, получен от междинния амин от водната среда, също остава под въпрос: той може да бъде или в кетонната група, или до –NH2.
В действителност нюансът с атома Н е незначителен, тъй като неговата позиция в съединението не играе особена роля в хода на реакцията, така че не трябва да се обръща внимание. Що се отнася до пропускането на един от възможните етапи, причината тук се крие в теоретичния аспект: досега точният механизъм за образуване на пурпура на Рюман не е точно определен, така че могат да се намерят доста различни схеми на нинхидриновата реакция.
Най-пълният възможен ход на взаимодействие на реагента с аминосъединенията ще бъде предложен по-долу.
Механизъм за реакция
Първо, нинхидринът взаимодейства с α-аминокиселина, като я прикрепя към мястото на разцепване на хидрокси групите и образува кондензационен продукт (фиг. 2а). След това последният се разрушава, освобождавайки междинния амин, алдехид и въглероден диоксид (фиг. 2б). От крайния продукт при присъединяваненинхидрин, се синтезира пурпурната структура на Rueman (дикетонхидринденкетохидринамин, фиг. 2в). Посочено е и възможното образуване на хидриндантин (редуциран нинхидрин) от междинния амин, който също се превръща в оцветяващо съединение в присъствието на амоняк (по-точно амониев хидроксид) с излишък от самия реагент (фиг. 2г).
Образуването на хидриндантин е доказано от самия Руман, когато сероводородът действа върху молекулата на нинхидрина. Това съединение е в състояние да се разтваря в натриев карбонат Na2CO3, оцветявайки разтвора в тъмно червено. И когато се добави разредена солна киселина, хидриндантинът се утаява.
Най-вероятно междинният амин, хидридантин, нинхидрин и структурата на багрилото, поради тяхната нестабилност при нагряване, са в някакво равновесие, което позволява наличието на няколко допълнителни етапа.
Този механизъм е подходящ за обяснение на реакцията на нинхидрин с други аминосъединения, с изключение на страничните продукти, получени от елиминирането на останалата част от структурата от –NH2, -NH или -N.
Биуретов тест и други реакции към протеини
Качествен анализ за пептидни връзки дори на непротеинови структури може да се осъществи не само с участието на горния реагент. Въпреки това, в случай на реакция на нинхидрин към протеини, взаимодействието не се осъществява покрай –CO-NH‒ групи, а по аминогрупи. Има така наречената "биуретна реакция", която се характеризира с добавяне на йони към разтвора с аминосъединениядвувалентна мед от CuSO4 или Cu(OH)2 в алкална среда (фиг. 3).
По време на анализа, в присъствието на необходимите структури, разтворът става тъмно син поради свързването на пептидните връзки в цветен комплекс, който отличава един реагент от друг. Ето защо реакциите на биурет и нинхидрин са универсални по отношение на протеинови и небелтъчни структури с –CO-NH‒ група.
При определяне на циклични аминокиселини се използва ксантопротеинова реакция с концентриран разтвор на азотна киселина HNO3 , която дава жълт цвят при нитриране. Капка реагент върху кожата също има жълт цвят, като реагира с аминокиселините в клетките на кожата. Азотната киселина може да причини изгаряния и трябва да се работи с ръкавици.
Примери за взаимодействие с аминосъединения
Реакцията на нинхидрин за α-аминокиселини дава добър визуален резултат, с изключение на структурите на цветния пролин и хидроксипролин, които реагират с образуването на жълт цвят. Възможно обяснение за този ефект е намерено в други условия на околната среда на взаимодействието на нинхидрин с тези структури.
Реакция с аминогрупа
Тъй като тестът не е специфичен, визуално откриване на аланин с помощта на нинхидриновата реакция в сместа не е възможно. Въпреки това, чрез хартиена хроматография, когато се прилагат проби от различни α-аминокиселини, пръскат се с воден разтвор на нинхидрин и се развива в специална среда, може да сеизчисляване на количествения състав не само на заявеното съединение, но и на много други.
Схематично взаимодействието на аланин с нинхидрин следва същия принцип. Той се свързва с реагента при аминогрупата и под действието на активни хидрониеви йони (H3O+) се отцепва при въглерода -азотна връзка, разлагаща се на ацеталдехид (CH3COH) и въглероден диоксид (CO2). Друга молекула нинхидрин се прикрепя към азота, измествайки водните молекули и се образува оцветяваща структура (фиг. 4).
Реакция с хетероциклично амино съединение
Реакцията на нинхидрин с пролин е специфична, особено при хроматографски анализи, тъй като такива структури в кисела среда първо стават жълти, а след това стават лилави в неутрална. Изследователите обясняват това с особеност на пренареждането на цикъла в междинното съединение, което се влияе именно от наличието на голям брой водородни протони, които допълват външното енергийно ниво на азота.
Разрушаването на хетероцикъла не настъпва и друга молекула нинхидрин е прикрепена към него при 4-тия въглероден атом. При по-нататъшно нагряване, получената структура в неутрална среда се превръща в лилаво на Rueman (фиг. 5).
Подготовка на основния реагент
Нинхидрин тест се провежда с различни разтвори, в зависимост от разтварянето на аминоструктурите в определени органични инеорганични съединения.
Основният реагент е приготвянето на 0,2% разтвор във вода. Това е универсална смес, тъй като повечето съединения се разтварят добре в H2O. За да се получи прясно приготвен реагент, проба от 0,2 g химически чист нинхидрин се разрежда в 100 ml вода.
Заслужава да се отбележи, че за някои анализирани разтвори тази концентрация е недостатъчна, така че могат да се приготвят 1% или 2% разтвори. Това е характерно за екстракти от лекарствени суровини, тъй като те съдържат различни класове аминосъединения.
При провеждане на хроматографски изследвания, разтвори, например, при промиване на смес върху твърд носител през колона, могат да се приготвят в алкохол, диметилсулфоксид, ацетон и други полярни разтворители - всичко ще зависи от разтворителя на определени амино структури.
Заявление
Реакцията на нинхидрин дава възможност за откриване на много аминосъединения в разтвор, което я прави една от първите, използвани в качествения анализ на органични вещества. Визуалното определяне значително намалява броя на експериментите, особено при анализиране на слабо проучени растения, лекарства и дозирани форми, както и неизвестни разтвори и смеси.
В съдебната медицина този метод се използва широко за определяне на наличието на следи от пот върху всяка повърхност.
Дори въпреки неспецифичността на реакцията, оттеглянето на реакцията на нинхидрин от химическата практика е невъзможно, т.к.замяната на това вещество с по-малко токсични аналози (например оксолин) доказа, че те имат по-лоша чувствителност към аминогрупи и не дават добри резултати при фотометричните анализи.
