Съвременната биология изумява с уникалността и мащаба на своите открития. Днес тази наука изучава повечето процеси, които са скрити от очите ни. Това е забележително за молекулярната биология – една от обещаващите области, която помага да се разгадаят най-сложните мистерии на живата материя.
Какво е обратна транскрипция
Обратната транскрипция (RT за кратко) е специфичен процес, характерен за повечето РНК вируси. Основната му характеристика е синтеза на двуверижна ДНК молекула, базирана на информационна РНК.
OT не е характерен за бактерии или еукариотни организми. Основният ензим, реверсетаза, играе ключова роля в синтеза на двойноверижна ДНК.
История на откриването
Идеята, че молекула на рибонуклеинова киселина може да се превърне в шаблон за синтез на ДНК, се смяташе за абсурдна до 70-те години на миналия век. Тогава Балтимор и Темин, работещи отделно един от друг, почти едновременно откриха нов ензим. Те го наричат РНК-зависима ДНК полимераза или обратна транскриптаза.
Откриването на този ензим безусловно потвърди съществуването на организмиспособен на обратна транскрипция. И двамата учени получиха Нобелова награда през 1975 г. След известно време Енгелхард предложи алтернативно име на обратната транскриптаза - ревертаза.
Защо ОТ противоречи на централната догма на молекулярната биология
Централната догма е концепцията за последователен протеинов синтез във всяка жива клетка. Такава схема е изградена от три компонента: ДНК, РНК и протеин.
Съгласно централната догма, РНК може да се синтезира изключително върху ДНК шаблона и едва тогава РНК участва в изграждането на първичната структура на протеина.
Тази догма беше официално приета в научната общност преди откриването на обратната транскрипция. Не е изненадващо, че идеята за обратен синтез на ДНК от РНК отдавна е отхвърлена от учените. Едва през 1970 г., заедно с откриването на реверсетазата, този проблем е прекратен, което е отразено в концепцията за протеинов синтез.
Възстановяване на птичи ретровируси
Процесът на обратна транскрипция не е завършен без участието на РНК-зависима ДНК полимераза. Ревертазата на птичия ретровирус е проучена в максимална степен до момента.
Само около 40 молекули от този протеин могат да бъдат намерени в един вирион от това семейство вируси. Протеинът се състои от две субединици, които са в еднакъв брой и изпълняват три важни функции на реверс:
1) Синтез на ДНК молекула както върху едноверижен/двойноверижен РНК шаблон, така и на базата на дезоксирибонуклеинови киселини.
2) Активиране на RNase H, чиято основна роля е даразцепване на РНК молекулата в РНК-ДНК комплекса.
3) Разрушаване на участъци от ДНК молекули за вмъкване в еукариотния геном.
Механизъм OT
Етапите на обратната транскрипция може да варират в зависимост от семейството на вирусите, т.е. от типа на техните нуклеинови киселини.
Нека първо разгледаме онези вируси, които използват реверстаза. Тук OT процесът е разделен на 3 стъпки:
1) Синтез на “-” РНК веригата върху шаблона “+” на РНК веригата.
2) Разрушаване на "+" веригата на РНК в комплекса РНК-ДНК с помощта на ензима РНКаза H.
3) Синтез на двуверижна ДНК молекула върху шаблона "-" на РНК веригата.
Този метод на репродукция на вириони е типичен за някои онкогенни вируси и човешкия имунодефицитен вирус (HIV).
Заслужава да се отбележи, че за синтеза на всяка нуклеинова киселина върху РНК шаблон е необходимо семе или праймер. Праймерът е кратка последователност от нуклеотиди, която е комплементарна на 3' края на РНК молекула (шаблон) и играе важна роля в инициирането на синтеза.
Когато готови двуверижни ДНК молекули от вирусен произход се интегрират в еукариотния геном, започва обичайният механизъм за синтез на вирион протеин. В резултат на това клетката, „уловена“от вируса, се превръща във фабрика за производство на вириони, където необходимите протеинови и РНК молекули се образуват в големи количества.
Друг начин за обратна транскрипция се основава на действието на РНК синтетазата. Този протеин е активен в парамиксовируси, рабдовируси, пикорновируси. В случая липсва трети етап на ОТ – формиранетодвуверижна ДНК и вместо това, „+“РНК верига се синтезира върху шаблона на вирусната „-“РНК верига и обратно.
Повтарянето на такива цикли води както до репликация на вирусния геном, така и до образуването на иРНК, способна да синтезира протеин в условията на заразена еукариотна клетка.
Биологично значение на обратната транскрипция
Процесът OT е от първостепенно значение в жизнения цикъл на много вируси (предимно ретровируси като ХИВ). РНК на вирион, който атакува еукариотна клетка, се превръща в шаблон за синтеза на първата ДНК верига, върху която не е трудно да се завърши втората верига.
Получената двуверижна ДНК на вируса се интегрира в еукариотния геном, което води до активиране на процесите на синтеза на вирионния протеин и появата на голям брой негови копия вътре в заразената клетка. Това е основната мисия на Revertase и OT като цяло за вируса.
Обратна транскрипция може да се появи и при еукариоти в контекста на ретротранспозони - мобилни генетични елементи, които могат независимо да транспортират от една част на генома в друга. Такива елементи според учените са причинили еволюцията на живите организми.
Ретротранспозонът е участък от еукариотна ДНК, който кодира няколко протеина. Една от тях, реверсетазата, участва пряко в делокализацията на такъв ретротранспозон.
Използване на ОТ в науката
От момента, в който реверсетазата беше изолирана в чиста форма, процесът на обратна транскрипция беше възприет от биолозите. Изучаването на OT механизма все още помага да се разчитат последователностите на най-важните човешки протеини.
Факт е, че геномът на еукариотите, включително и на нас, съдържа неинформативни области, наречени интрони. Когато от такава ДНК се разчете нуклеотидна последователност и се образува едноверижна РНК, последната губи интрони и кодира изключително протеин. Ако ДНК се синтезира с помощта на реверстаза върху РНК шаблон, тогава е лесно да се секвенира и да се установи реда на нуклеотидите.
Нуклеинова киселина, която е образувана чрез обратна транскриптаза, се нарича cDNA. Често се използва в полимеразна верижна реакция (PCR) за изкуствено увеличаване на броя на копията на полученото копие на сДНК. Този метод се използва не само в науката, но и в медицината: лаборантите определят приликата на такава ДНК с геномите на различни бактерии или вируси от обща библиотека. Синтезът на вектори и тяхното въвеждане в бактериите е една от обещаващите области на биологията. Ако RT се използва за образуване на ДНК на хора и други организми без интрони, такива молекули могат лесно да бъдат въведени в бактериалния геном. Така последните се превръщат в фабрики за производство на вещества, необходими за човек (например ензими).
