Протеинът е основен компонент на всички организми. Всяка от неговите молекули се състои от една или повече полипептидни вериги, състоящи се от аминокиселини. Въпреки че информацията, необходима за живота, е кодирана в ДНК или РНК, рекомбинантните протеини изпълняват широк спектър от биологични функции в организмите, включително ензимна катализа, защита, подкрепа, движение и регулиране. Според функциите им в организма тези вещества могат да бъдат разделени на различни категории, като антитела, ензими, структурен компонент. Предвид техните важни функции, такива съединения са интензивно изследвани и широко използвани.
В миналото основният начин за получаване на рекомбинантен протеин беше да се изолира от естествен източник, което обикновено е неефективно и отнема много време. Последните постижения в биологичните молекулярни технологии направиха възможно клонирането на ДНК, кодираща специфичен набор от вещества, в експресионен вектор за вещества като бактерии, дрожди, клетки от насекоми и клетки на бозайници.
Просто казано, рекомбинантните протеини се превеждат от екзогенни ДНК продукти вживи клетки. Получаването им обикновено включва две основни стъпки:
- Клониране на молекула.
- Протеинов израз.
В момента производството на такава структура е един от най-мощните методи, използвани в медицината и биологията. Съставът има широко приложение в изследванията и биотехнологиите.
Медицинско направление
Рекомбинантните протеини осигуряват важни лечения за различни заболявания като диабет, рак, инфекциозни заболявания, хемофилия и анемия. Типичните формулировки на такива вещества включват антитела, хормони, интерлевкини, ензими и антикоагуланти. Има нарастваща нужда от рекомбинантни формулировки за терапевтична употреба. Те ви позволяват да разширите методите на лечение.
генетично проектираните рекомбинантни протеини играят ключова роля на пазара на терапевтични лекарства. Понастоящем клетките на бозайниците произвеждат най-много терапевтични агенти, тъй като техните формулировки са способни да произвеждат висококачествени, естествени вещества. В допълнение, много одобрени рекомбинантни терапевтични протеини се произвеждат в E. coli поради добра генетика, бърз растеж и висока производителност. Освен това има положителен ефект върху разработването на лекарства на основата на това вещество.
Изследване
Получаването на рекомбинантни протеини се основава на различни методи. Веществата помагат да се открият основните и фундаментални принципи на тялото. Тези молекули могат да се използват за идентифициране и определянеместоположение на веществото, кодирано от конкретен ген, и за разкриване на функцията на други гени в различни клетъчни дейности, като клетъчна сигнализация, метаболизъм, растеж, репликация и смърт, транскрипция, транслация и модификация на съединенията, обсъждани в статията.
По този начин наблюдаваният състав често се използва в молекулярната биология, клетъчната биология, биохимията, структурните и биофизични изследвания и много други области на науката. В същото време получаването на рекомбинантни протеини е международна практика.
Такива съединения са полезни инструменти за разбиране на междуклетъчните взаимодействия. Те са доказали своята ефективност в няколко лабораторни метода като ELISA и имунохистохимия (IHC). Рекомбинантните протеини могат да се използват за разработване на ензимни анализи. Когато се използват в комбинация с двойка подходящи антитела, клетките могат да се използват като стандарти за нови технологии.
Биотехнология
Рекомбинантни протеини, съдържащи аминокиселинна последователност, също се използват в индустрията, производството на храни, селското стопанство и биоинженерството. Например в животновъдството ензими могат да се добавят към храната, за да се повиши хранителната стойност на фуражните съставки, да се намалят разходите и отпадъците, да се поддържа здравето на червата на животните, да се подобри производителността и да се подобри околната среда.
В допълнение, млечнокиселите бактерии (LAB) за дълго времеса били използвани за производство на ферментирали храни, а наскоро LAB беше разработен за експресия на рекомбинантни протеини, съдържащи аминокиселинна последователност, която може да се използва широко, например за подобряване на храносмилането при хора, животни и храни.
Въпреки това, тези вещества също имат ограничения:
- В някои случаи производството на рекомбинантни протеини е сложно, скъпо и отнема много време.
- Веществата, произведени в клетките, може да не съответстват на естествените форми. Тази разлика може да намали ефективността на терапевтичните рекомбинантни протеини и дори да причини странични ефекти. В допълнение, тази разлика може да повлияе на резултатите от експериментите.
- Основният проблем с всички рекомбинантни лекарства е имуногенността. Всички биотехнологични продукти могат да проявяват някаква форма на имуногенност. Трудно е да се предвиди безопасността на новите терапевтични протеини.
Като цяло напредъкът в биотехнологиите се увеличи и улесни производството на рекомбинантни протеини за различни приложения. Въпреки че все още имат някои недостатъци, веществата са важни в медицината, научните изследвания и биотехнологиите.
Връзка към болестта
рекомбинантният протеин не е вреден за хората. Той е само неразделна част от цялостната молекула при разработването на определено лекарство или хранителен елемент. Много медицински проучвания показват, че принудителната експресия на протеина FGFBP3 (съкратено BP3) в лабораторен щам на затлъстели мишки показва значително намаляване на телесните им мазнини.маса, въпреки генетичната предразположеност за употреба.
Резултатите от тези проучвания показват, че протеинът FGFBP3 може да предложи нова терапия за нарушения, свързани с метаболитен синдром, като диабет тип 2 и мастно чернодробно заболяване. Но тъй като BP3 е естествен протеин, а не изкуствено лекарство, клиничните изпитвания на рекомбинантен човешки BP3 могат да започнат след последния кръг от предклинични проучвания. Тоест има причини, свързани с безопасността на провеждането на такива изследвания. Рекомбинантният протеин не е вреден за хората поради неговата поетапна обработка и пречистване. Настъпват промени и на молекулярно ниво.
PD-L2, един от ключовите играчи в имунотерапията, беше номиниран за Нобелова награда за физиология и медицина за 2018 г. Тази работа, започната от проф. Джеймс П. Алисън от САЩ и проф. Тасуку Хонджо от Япония, доведе до лечение на ракови заболявания като меланом, рак на белия дроб и други въз основа на имунотерапия на контролни точки. Наскоро AMSBIO добави важен нов продукт към своята имунотерапевтична линия, PD-L2/TCR активаторът - CHO Recombinant Cell Line.
В експерименти за доказване на концепцията, изследователи от Университета на Алабама в Бирмингам, водени от H. Long Zheng, MD, професор Робърт Б. Адамс, и директор на Лабораторна медицина, Отделение по патология, UAB School of Медицината, подчертаха потенциална терапия на рядко, но фатално разстройство на кървенето, TTP.
Резултатите от товапроучванията показват за първи път, че трансфузията на заредени с rADAMTS13 тромбоцити може да бъде нов и потенциално ефективен терапевтичен подход за артериална тромбоза, свързана с вродена и имунно-медиирана TTP.
Рекомбинантният протеин е не само хранително вещество, но и лекарство в състава на лекарството, което се разработва. Това са само няколко области, които сега се занимават с медицината и са свързани с изучаването на всички нейни структурни елементи. Както показва международната практика, структурата на веществото позволява на молекулярно ниво да се справя с много сериозни проблеми в човешкото тяло.
Разработване на ваксини
Рекомбинантният протеин е специфичен набор от молекули, които могат да бъдат моделирани. Подобно свойство се използва при разработването на ваксини. Нова стратегия за ваксинация, известна още като използването на специална рекомбинантна вирусна инжекция, може да защити милиони пилета, изложени на риск от сериозно респираторно заболяване, казаха изследователи от Университета в Единбург и института Пирбрайт. Тези ваксини използват безвредни или слаби версии на вирус или бактерия за въвеждане на микроби в клетките на тялото. В този случай експертите са използвали рекомбинантни вируси с различни шипови протеини като ваксини, за да създадат две версии на безвреден вирус. Има много различни лекарства, изградени около тази връзка.
Рекомбинантните протеинови търговски имена и аналози са както следва:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Това са основно противоракови лекарства, но има и други области на лечение, свързани с това активно вещество.
Нова ваксина, наречена още LASSARAB, предназначена да предпазва хората както от треска Ласа, така и от бяс, показа обещаващи резултати в предклиничните проучвания, според ново проучване, публикувано в научното списание Nature Communications. Кандидат за инактивирана рекомбинантна ваксина използва отслабен вирус на бяс.
Изследователският екип вмъкна генетичен материал на вируса на Ласа във вектор на вируса на бяс, така че ваксината да експресира повърхностни протеини както в клетките на Ласа, така и в клетките на бяс. Тези повърхностни съединения предизвикват имунен отговор срещу инфекциозни агенти. След това тази ваксина беше дезактивирана, за да „унищожи“живия вирус на бяс, използван за направата на носителя.
Методи за получаване
Има няколко системи за производство на вещество. Общият метод за получаване на рекомбинантен протеин се основава на получаването на биологичен материал от синтеза. Но има и други начини.
В момента има пет основни системи за изразяване:
- Е. coli експресионна система.
- Система за експресиране на дрожди.
- Система за експресия на клетки от насекоми.
- Система за експресия на клетки от бозайници.
- Безклетъчна протеинова експресионна система.
Последният вариант е особено подходящ за експресия на трансмембранни протеинии токсични съединения. През последните години вещества, които трудно се експресират чрез конвенционални вътреклетъчни методи, бяха успешно интегрирани в клетките in vitro. В Беларус производството на рекомбинантни протеини е широко използвано. Има редица държавни предприятия, които се занимават с този проблем.
Cell Free Protein Synthesis System е бърз и ефективен метод за синтезиране на целеви вещества чрез добавяне на различни субстрати и енергийни съединения, необходими за транскрипция и транслация в ензимната система от клетъчни екстракти. През последните години предимствата на безклетъчните методи за видове вещества като сложни, токсични мембрани постепенно се появиха, демонстрирайки тяхното потенциално приложение в биофармацевтичната област.
Безклетъчната технология може да добавя разнообразие от неестествено срещащи се аминокиселини лесно и по контролиран начин за постигане на сложни процеси на модификация, които са трудни за разрешаване след конвенционална рекомбинантна експресия. Такива методи имат висока приложна стойност и потенциал за доставяне на лекарства и разработване на ваксини с помощта на вирусоподобни частици. Голям брой мембранни протеини са успешно експресирани в свободни клетки.
Изразяване на композиции
Рекомбинантен протеин CFP10-ESAT 6 се произвежда и използва за създаване на ваксини. Такъв туберкулозен алерген ви позволява да укрепите имунната система и да разработите антитела. Като цяло, молекулярните изследвания включват изследване на всеки аспект на протеин, като структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия. Да проучикак специфични вещества регулират вътрешните процеси, изследователите обикновено изискват средства за производство на функционални съединения от интерес и полза.
Като се има предвид размера и сложността на протеините, химическият синтез не е жизнеспособен вариант за това начинание. Вместо това живите клетки и техните клетъчни машини обикновено се използват като фабрики за създаване и конструиране на вещества въз основа на предоставените генетични шаблони. Рекомбинантната протеинова експресионна система след това генерира необходимата структура за създаване на лекарство. Следва изборът на необходимия материал за различните категории лекарства.
За разлика от протеините, ДНК е лесно да се конструира синтетично или ин витро с помощта на добре установени рекомбинантни техники. Следователно, ДНК шаблони на специфични гени, със или без добавени репортерни последователности или афинитетни маркерни последователности, могат да бъдат проектирани като шаблони за експресия на наблюдаваното вещество. Такива съединения, получени от такива ДНК шаблони, се наричат рекомбинантни протеини.
Традиционните стратегии за експресия на вещество включват трансфектиране на клетки с ДНК вектор, който съдържа шаблон и след това култивиране на клетките за транскрибиране и транслация на желания протеин. Обикновено клетките след това се лизират за екстрахиране на експресираното съединение за последващо пречистване. Рекомбинантният протеин CFP10-ESAT6 се обработва по този начин и преминава през система за пречистване от възможниобразуването на токсини. Едва след това отива да бъде синтезиран във ваксина.
И прокариотните, и еукариотните in vivo експресионни системи за молекулярни вещества са широко използвани. Изборът на система зависи от вида на протеина, изискването за функционална активност и желания добив. Тези експресионни системи включват бозайници, насекоми, дрожди, бактерии, водорасли и клетки. Всяка система има своите предимства и предизвикателства и изборът на правилната система за конкретно приложение е важен за успешното изразяване на субстанцията, която се разглежда.
Израз от бозайници
Използването на рекомбинантни протеини позволява разработването на ваксини и лекарства от различни нива. За това може да се използва този метод за получаване на вещество. Системите за експресия на бозайници могат да се използват за производство на протеини от животинското царство, които имат най-природната структура и активност поради тяхната физиологично релевантна среда. Това води до високи нива на посттранслационна обработка и функционална активност. Експресионни системи при бозайници могат да се използват за производство на антитела, сложни протеини и съединения за използване в клетъчно-базирани функционални анализи. Тези предимства обаче са съчетани с по-строги културни условия.
Системи за експресия на бозайници могат да се използват за генериране на протеини временно или чрез стабилни клетъчни линии, където експресионната конструкция е интегрирана в генома на гостоприемника. Докато такива системи могат да се използват в множество експерименти, времетопроизводството може да генерира голямо количество вещество за една до две седмици. Този тип рекомбинантна протеинова биотехнология е много търсена.
Тези преходни, високопроизводителни експресионни системи при бозайници използват суспензионни култури и могат да дадат грамове на литър. В допълнение, тези протеини имат по-нативно сгъване и пост-транслационни модификации като гликозилиране в сравнение с други експресионни системи.
Израз на насекоми
Методите за производство на рекомбинантен протеин не се ограничават само до бозайници. Има и по-продуктивни начини по отношение на производствените разходи, въпреки че добивът на вещество от 1 литър третирана течност е много по-нисък.
Клетките на насекомите могат да се използват за експресиране на протеин с високо ниво с модификации, подобни на системите на бозайници. Има няколко системи, които могат да се използват за генериране на рекомбинантен бакуловирус, който след това може да се използва за извличане на веществото, което представлява интерес в клетките на насекоми.
Експресиите на рекомбинантни протеини могат лесно да бъдат увеличени и адаптирани към суспензионна култура с висока плътност за широкомащабно смесване на молекули. Те са по-функционално подобни на естествения състав на материята на бозайниците. Въпреки че добивът може да бъде до 500 mg/L, производството на рекомбинантен бакуловирус може да отнеме време и условията на култивиране са по-трудни от прокариотните системи. Въпреки това, в по-южните и по-топли страни, подобнометодът се счита за по-ефективен.
Бактериален израз
Производството на рекомбинантни протеини може да се установи с помощта на бактерии. Тази технология е много по-различна от описаната по-горе. Системите за експресия на бактериални протеини са популярни, защото бактериите са лесни за култивиране, растат бързо и дават високи добиви от рекомбинантната формулировка. Въпреки това, многодомейните еукариотни вещества, експресирани в бактерии, често са нефункционални, тъй като клетките не са оборудвани да извършват необходимите пост-транслационни модификации или молекулярно сгъване.
В допълнение, много протеини стават неразтворими като включващи молекули, които са много трудни за възстановяване без сурови денатуратори и последващи тромави процедури за повторно нагъване на молекули. Този метод се смята най-вече за все още до голяма степен експериментален.
Изразяване без клетки
Рекомбинантният протеин, съдържащ аминокиселинната последователност на стафилокиназа, се получава по малко по-различен начин. Включен е в много видове инжекции, изискващи няколко системи преди употреба.
Безклетъчна експресия на протеин е in vitro синтез на вещество с помощта на транслационно съвместими екстракти от цели клетки. По принцип екстрактите от цели клетки съдържат всички макромолекули и компоненти, необходими за транскрипция, транслация и дори посттранслационна модификация.
Тези компоненти включват РНК полимераза, регулаторни протеинови фактори, транскрипционни форми, рибозоми и tRNA. При добавянекофактори, нуклеотиди и специфичен генен шаблон, тези екстракти могат да синтезират протеини от интерес за няколко часа.
Въпреки че не са устойчиви за широкомащабно производство, системите за експресия на протеини без клетки или in vitro (IVT) предлагат редица предимства пред конвенционалните системи in vivo.
Безклетъчна експресия позволява бърз синтез на рекомбинантни формулировки без участието на клетъчна култура. Безклетъчните системи позволяват да се маркират протеини с модифицирани аминокиселини, както и да се експресират съединения, които претърпяват бързо протеолитично разграждане от вътреклетъчни протеази. Освен това е по-лесно да се експресират много различни протеини едновременно с помощта на безклетъчен метод (например тестване на протеинови мутации чрез малка експресия от много различни рекомбинантни ДНК шаблони). В този представителен експеримент системата IVT беше използвана за експресиране на човешкия протеин каспаза-3.
Заключения и бъдещи перспективи
Производството на рекомбинантни протеини вече може да се разглежда като зряла дисциплина. Това е резултат от множество постепенни подобрения в пречистването и анализа. Понастоящем програмите за откриване на лекарства рядко се спират поради невъзможност за производство на целевия протеин. Паралелните процеси за изразяване, пречистване и анализ на няколко рекомбинантни вещества вече са добре познати в много лаборатории по света.
Протеинови комплекси и нарастващ успех в производствоторазтворените мембранни структури ще изискват повече промени, за да бъдат в крак с търсенето. Появата на ефективни договорни изследователски организации за по-редовно снабдяване с протеини ще позволи преразпределянето на научни ресурси за посрещане на тези нови предизвикателства.
Освен това, паралелните работни потоци трябва да позволят създаването на пълни библиотеки на наблюдаваното вещество, за да се даде възможност за идентифициране на нова цел и усъвършенстван скрининг, заедно с традиционни проекти за откриване на лекарства с малки молекули.
