Оцветяването по Грам се използва широко в микробиологията, тъй като е един от най-лесните начини за диференциране на бактериите въз основа на състава на тяхната клетъчна стена. Според Грам всички бактерии могат да бъдат разделени на грам-положителни (Грам (+)) и грам-отрицателни (Грам (-)). Методът за оцветяване по Грам е разработен през 1884 г. и не е загубил популярност оттогава, въпреки че е бил модифициран няколко пъти.
Структура на клетъчната стена
Оцветяването по Грам разкрива дали дадена бактерия е Грам-положителна или Грам-отрицателна. Разделянето на бактериите на Грам (+) и Грам (-) се извършва в съответствие със структурата на тяхната клетъчна стена.
Клетъчната стена съдържа най-голямо количество пептидогликан (муреин) - сложно вещество, което включва пептапептид и гликан. Гликанът се състои от редуващи се остатъци от N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамова киселина, свързани помежду си чрез β-1,4-гликозидни връзки. Пептидогликанът осигурява поддържане на формата на клетките, осмотична защита и антигенни функции.
Основни разлики между грам-положителни и грам-отрицателни бактерии
Различните бактерии имат различна дебелина на пептидогликановия слой. При бактериите, които са класифицирани като грам-положителни, той варира от 15 до 80 nm, докато при грам-отрицателните е от 2 до 8 nm. В същото време Грам-отрицателните бактерии имат специална структура под пептидогликановия слой, каквато Грам-положителните бактерии нямат - периплазменото пространство. Това пространство е изпълнено с хидролитични ензими - β-лактамаза, рибонуклеаза 1, фосфатаза. Именно тези ензими са отговорни за резистентността на грам-отрицателните бактерии към много антибиотици.
Грам(-) пептидогликановият слой на бактериите е свързан с липополизахарид, антигенна структура, съдържаща ендотоксин. В Грам(+) бактериите тейхоевите киселини изпълняват подобни функции.
Грам-отрицателните бактерии имат допълнителна структура - външната мембрана.
Същността на метода на оцветяване
Преди да започнете да оцветявате, се приготвят намазки от изследваните бактерии. За да направите това, вода се накапва върху предметно стъкло и там се добавя култура от микроорганизми с бактериална бримка. След това, след като водата напълно изсъхне, намазката се фиксира - предметното стъкло се пренася няколко пъти над пламъка на горелката. Оцветяването по Грам е по-ефективно от оцветяването на живи бактерии - молекулите на багрилото се свързват по-добре с мъртвите клетки.
Оцветяването се извършва на няколко етапа:
- Малки парчета филтърна хартия се поставят върху фиксирана намазка и се излива основното багрило - генциан виолет или метиленово синьо.
- След 3-5 минути отстранете цветната филтърна хартия и напълнете намазката с разтвор на Лугол за 1 минута. В този случай препаратът потъмнява.
- Разтворът на Лугол се отцежда и намазката се обработва с чист етилов алкохол: няколко капки се накапват върху препарата, отцеждат се след 20 секунди. Процедурата се повтаря 2-3 пъти.
- Изплакнете предметното стъкло с дестилирана вода.
- Направете допълнително оцветяване - завършете подготовката с фуксин. След 1-2 минути боята се отмива.
- След като водата изсъхне, разгледайте намазката под микроскоп. Грам-положителните бактерии ще бъдат синьо-виолетови, Грам-отрицателните бактерии ще бъдат розови или червени.
Причини за различни модели на оцветяване
Както е описано по-горе, оцветяването по Грам на бактериите оцветява Грам-положителните бактерии в синьо-виолетово, докато Грам-отрицателните бактерии оцветяват в червено или розово. Причината за диференциалното оцветяване на бактериите по този метод е, че след като разтворимата форма на генциан виолет навлезе в клетката, багрилото преминава в неразтворимата йодна форма. По време на третирането на бактериите с етилов алкохол, липидите се извличат от мембраната под действието на този неполярен разтворител. След това мембраната става пореста и вече не е значителна пречка за излугването на багрилото. въпреки товапептидогликанът е по-устойчив на неполярни разтворители, включително алкохол. Той е този, който предотвратява отмиването на боята, така че бактериите с дебел муреинов слой стават синьо-виолетови (грам-положителни) и след третиране с алкохол не променят цвета си.
Тънък муреинов слой от грам-отрицателни бактерии не могат да задържат молекулите на багрилото в клетката, така че след действието на алкохола те стават безцветни - оцветяват грам-отрицателни.
След излагане на намазка на фуксин, оцветените по Грам бактерии остават синьо-виолетови, докато грам-отрицателните бактерии стават розово-червени.
Примери за грам(+) и грам(-) бактерии
Грам-отрицателните бактерии включват цианобактерии, серни бактерии, железни бактерии, хламидия, рикетсии, оцетни бактерии, много метилобактерии, тионни бактерии, арсенитобактерии, карбоксибактерии.
Бифидобактерии, много водни бактерии, стрептококи и стафилококи са Грам-положителни.
